UNIDAD 9

  INSTITUTO  TECNOLOGICO DE CIUDAD ALTAMIRANO

"BIOLOGIA MOLECULAR"

  

PRESENTA

MARICRUZ HERRERA MAYA

 9.1 MECANISMOS DE TRANSFERENCIA NATURAL

CARACTERES GENERALES

·        

      El ADN, para que sea capaz de transformar, ha de ser de cadena doble.

·         Para cada evento de transformación basta la interacción de una sola molécula de ADN con la célula receptora.

·         No todas las células de un mismo cultivo son transformables en cualquier momento del ciclo de crecimiento. La competencia es el estado fisiológico característico que permite captar ADN del medio exterior. Este estado de competencia es diferente para cada especie bacteriana capaz de experimentar transformación, y dentro de cada especie está influido por una serie de parámetros como:

En la transformación natural de diversas especies bacterianas se dan una serie de fases comunes a todas ellas, aunque en cada caso existen rasgos propios:

1. Competencia
2. Unión y entrada del ADN exógeno a la célula
3. Fase de eclipse
4. Destino del ADN exógeno (exogenote): recombinación con el endogenote.

Existen varios géneros con especies que poseen sistemas naturales de transformación:

*BACTERIAS GRAM POSITIVAS   

	Streptococcus
	Bacillus

*BACTERIAS GRAM NEGATIVAS:

	Haemophilus
	Neisseria
	Moraxella
	Acinetobacter
	Azotobacter
	Pseudomonas
	Cianobacterias del gén. Synechococcus

9.1.1 TRANSFORMACION

Variación hereditaria de una célula bacteriana susceptible, originada por la captación de ADN desnudo libre en el medio, con la posterior recombinación del exogenote con el genomio de la célula en cuestión (endogenote).

La transformación fue el primer proceso de transferencia genética que se describió en los procariotas, y este hallazgo constituyó la base para suministrar el primer dato incontrovertible acerca de la naturaleza química del material genético: a partir de 1944 empezó a quedar claro que era el ADN el portador de la información genética de los seres vivos.

Todo comenzó con los trabajos de Griffith (1928) sobre el neumococo. Recuérdense sus clásicos experimentos con las cepas S (lisas, capsuladas y virulentas) y R (rugosas, no capsuladas y avirulentas), inoculadas en ratones: Cepas S vivas inoculadas en ratones à ratón muere Cepas R vivas inoculadas en ratones à ratón vive Cepas S muertas por calorà ratón vive Cepas S muertas por calor + R vivas à ratón muere. La autopsia revela la presencia de neumococos vivos virulentos (tipo S).

 9.1.2 CONJUGACION

Es el proceso de transferencia de información genética desde una célula bacteriana donadora a otra receptora. Este proceso fue descubierto por Joshua Lederberg y Edward Tatum en 1946. Este proceso es promovido por determinados tipos de plásmidos, que portan un conjunto de genes cuyos productos participan en el proceso, y que requiere contactos directos entre ambas células, con intervención de estructuras superficiales especializadas y de funciones específicas (pilus sexuales en los Gram negativos, y contacto íntimo en los Gram positivos).

Este proceso se lleva a cabo si la célula presenta el plásmido F, que contiene la información genética para formar pili, puentes que sirven de unión citoplásmica entre dos bacterias. La célula que presenta el plásmido se denomina F+; la célula que no lo contiene se llama F-. La bacteria F+ (donadora de información) se une a una bacteria F- (receptora) mediante uno de sus pili.

A través de él introduce una hebra del plásmido F, de forma que la bacteria F- se convierte en bacteria F+.En ocasiones el plásmido se introduce en el anillo del ADN bacteriano. Entonces, la bacteria donadora se denomina Hfr (High frequency of recombination). De esta forma la bacteria Hfr puede donar a otras células cualquier gen de su ADN.

9.1.3 TRANSDUCCION

 

Es un proceso mediante el cual el ADN es transferido desde una bacteria a otra mediante la acción de un virus. También se utiliza para designar al proceso mediante el cual ADN exógeno es introducido en una célula mediante un vector viral. Esta es una herramienta que usualmente utilizan los biólogos moleculares para introducir en forma controlada un gen extraño en el genoma de una célula receptora

  

CICLOS LÍTICO Y LISOGÉNICO

El proceso de transducción puede ocurrir tanto durante un ciclo lítico  como durante un ciclo lisogénico.

El bacteriófago entra en ciclo lisogénico cuando su genoma se integra en el cromosoma bacteriano, donde puede permanecer latente durante miles de generaciones. Si el lisógeno es inducido (por exposición a luz UV, por ejemplo) el genoma del fago se escinde del cromosoma bacteriano e inicia un ciclo lítico, que desemboca en la lisis de la célula y la liberación de las nuevas partículas víricas.

 Cuando una célula es atacada por un virus bacteriófago, la bacteria genera nuevas copias del ADN vírico. En la fase de ensamblaje se pueden introducir fragmentos de ADN bacteriano en la cápsida del virus. Los nuevos virus ensamblados infectarán nuevas células. Mediante este mecanismo, una célula podrá recibir ADN de otra bacteria e incorporar nueva información.

 

Los bacteriófagos son virus que parasitan bacterias. Tienen una estructura compleja formada por una cabeza, que contiene el material genético, y una cola que consta de unas fibras con las que se anclan a la superficie bacteriana. El material genético del bacteriófago pasa desde la cabeza, a través de la cola, hasta el interior de la bacteria.

                                    9.1.4 RECOMBINACION

Es el proceso por el cual una hebra de material genético (usualmente ADN; pero también puede ser ARN) es rota y luego unida a una molécula de material genético diferente. La recombinación de eucariotas comúnmente se produce durante la meiosis como entrecruzamiento cromosómico entre los cromosomas apareados. Este proceso conduce a que la progenie tenga diferentes combinaciones de genes de sus padres y puede producir alelos quiméricos. En biología evolutiva se cree que esta mezcla de genes tiene varias ventajas, incluyendo que permite a los organismos que se reproducen sexualmente y evitar el trinquete de Muller.

  

                               TIPOS DE RECOMBINACION

Recombinación homóloga: La recombinación homóloga (también llamada recombinación general) sucede durante la  profosa I de la  meiosis y tiene lugar entre las largas regiones de ADN cuyas secuencias son homólogas, es decir altamente similares pero no idénticas.

  

Recombinación específica de sitio: Otro tipo de recombinación es la específica de sitio que tiene lugar por rotura y posterior unión de regiones de homología corta y específica de dos ADN diferentes, o dentro de la misma molécula. Ocurre en virus (por ejemplo, el   Bacteriofago T4) y en plásmidos. 

Recombinación no homóloga: La recombinación puede ocurrir entre secuencias de ADN que no contienen secuencias homólogas. Esto es conocido como recombinación no homóloga. Acontece raramente en procariotas y levaduras, pero es más frecuente en células de mamíferos.

           9.1.5 TRANSFECCION

 

 Consiste en la introducción de material genético externo en células eucariotas mediante plásmidos, vectores víricos (en este caso también se habla de transducción) u otras herramientas para la transferencia.

Las técnicas de transfección celular, que se han desarrollado fundamentalmente para permitir la introducción de ácidos nucleicos en el interior de las células, han permitido en gran medida ampliar los conocimientos acerca de la regulación génica y de la función de las proteínas en los sistemas celulares. Actualmente se emplean en gran número de aproximaciones experimentales, en la generación de animales transgénicos, en la selección de líneas celulares modificadas.

La introducción de una construcción de DNA recombinante en la que se ha situado el CDS (secuencia codificante) de un gen reportero (luciferasa, 'green fluorescent protein', beta-galactosidasa, cloramfenicol acetiltransferasa -CAT-, etc..) bajo una secuencia de regulación que se desea estudiar permite medir con facilidad tasas de expresión génica en diferentes situaciones experimentales.

       9.2 MECANISMOS DE TRANSFERENCIA ARTIFICIAL

9.2.1 FISICOS

 Los métodos físicos utilizan técnicas como la microinyección con una fina aguja de cristal y la electroporación (exposición de las células aun choque eléctrico).

 Microinyección: Resulta ser una técnica muy potente y eficaz, ya que 1 de cada 5 células consigue incorporar el DNA foráneo de forma permanente. El problema de esta técnica es que exclusivamente se puede inyectar una célula cada vez, y por tanto no es el más recomendable para una terapia médica debido a que es demasiado laboriosa como para obtener un número de células indicadas (suficientes, aproximadamente un millar o más) para que el tratamiento tenga éxito. Es una técnica muy efectiva aunque laboriosa. Es el método que se emplea en la introducción del DNA recombinante en las células embrionarias en el proceso de obtención de animales transgénicos 

Electrooración: Es una técnica que crea o que dota a la membrana de cierta permeabilidad al DNA durante unos pocos segundos debido a una descarga eléctrica. Si la célula o grupo de células sometidas, a dicho choque eléctrico están sumergidas en un medio rico en plásmidos, alguno de ellos puede penetrar en una célula. El problema que suscita este método es que los choques eléctricos no pueden producir los efectos deseados en algunas células y dañarlas o matarlas debido a esta causa.

Una vez introducida la molécula de DNA recombinante en el interior de las células producirá su efecto permitiendo, por ejemplo :

• Seleccionar células que hayan incorporado el DNA. Este sería el caso del aislamiento de clones celulares que presentaran expresión de un determinado producto. Es posible por la incorporación en el propio vector de marcadores de selección, típicamente la resistencia de G418 (neomicina),

A las pocas horas o dias detectar la presencia de la proteína codificada por elplasmido.

9.2.2  QUIMICOS

  Método del fosfato cálcico. Basado en la obtención de un precipitado entre el cloruro de calcio y el DNA en una solución salina de fosfatos. En esta situación co-precipitan formando unos agregados que son endocitados/fagocitados por las células. Aparentemente el agregado con calcio protege al DNA de la degradación por las nucleasas celulares. El tamaño y la calidad del precipitado es crítico para el éxito del proceso, que se ve afectado por factores tales como pequeños cambios en el pH de la solución, etc...  

           

 Método del DEAE dextrano. Basado en la obtención de complejos entre la resina DEAE y el DNA. Los polímeros de DEAE dextrano o polybreno tienen una carga que les permite unirse a las muy negativamente cargadas moléculas de DNA. El DNA acomplejado se introduce en las células mediante choque osmótico mediante DMSO o glicerol. El uso de DEAE dextrano se limita a las transfecciones transientes. 

 Método DNA desnudo. El DNA desnudo (técnica en fase altamente experiemtal) es incapaz de entrar en una célula y aún consiguiendo entrar en ellas es rápidamente degradado. La línea de investigación busca incorporar esas secuencias de DNA a un transportador, que le encierra y le lleva hasta la célula Diana en dónde a través de interacciones de membrana se asocia con ella para entregar el material al interior.
  
Método Péptidos fusiogénicos Los  péptidos fusiogénicos surgen en una linea de trabajo que nos permita paliar aquellas características del DNA desnudo que nos impiden la entrada.

 Estos péptidos fusiogénicosa se utilizan para compactar DNA. y de este modo adoptan DNA con proteínas ricas en cargas +, del tipos Histonas. Esto supone una condensación considerable, (visible con MET) ya que el DNA aparece en la forma de partículas de 50-150 nanometros, pero sólo un cierto grado de condensación permite que 1 transportador incluya 1 molécula de DNA. Asimismo la reducción de tamaño del DNA hasta unos 20 nanometros facilitaría el paso a la célula y hasta el núcleo, incrementando su protección contra las nucleases citoplasmáticas. En el proceso de penetración celular, los transportadores sintéticos (si su carga neta es +) interactuan con Aminoazucares de la Membrana plasmáticacon (carga -) para producir la incorporación a la célula en forma de endosomas. Por tanto tenemos un problema más a superar.

Método  de Liposomas: Los liposomas estan formados por DNA y lipidos no inmunogénicos cargados positivamente (lípidos cationicos).