"BIOLOGIA MOLECULAR"
PRESENTA
MARICRUZ HERRERA MAYA
9.1 MECANISMOS DE
TRANSFERENCIA NATURAL
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El ADN, para que sea capaz de transformar, ha de
ser de cadena doble.
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Para cada evento de transformación basta la
interacción de una sola molécula de ADN con la célula receptora.
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No todas las células de un mismo cultivo son
transformables en cualquier momento del ciclo de crecimiento. La competencia
es el estado fisiológico característico que permite captar ADN del medio
exterior. Este estado de competencia es diferente para cada especie bacteriana
capaz de experimentar transformación, y dentro de cada especie está influido
por una serie de parámetros como:
En la transformación natural de diversas especies bacterianas se dan una
serie de fases comunes a todas ellas, aunque en cada caso existen rasgos
propios:
- Competencia
- Unión y entrada del ADN exógeno a la célula
- Fase de eclipse
- Destino del ADN exógeno (exogenote): recombinación con el endogenote.
Existen varios géneros con especies que poseen sistemas naturales de
transformación:
*BACTERIAS GRAM POSITIVAS
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Streptococcus
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Bacillus
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*BACTERIAS GRAM NEGATIVAS:
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Haemophilus
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Neisseria
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Moraxella
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Acinetobacter
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Azotobacter
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Pseudomonas
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Cianobacterias del gén. Synechococcus
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9.1.1 TRANSFORMACION
Variación
hereditaria de una célula bacteriana susceptible, originada por la captación
de ADN desnudo libre en el medio, con la posterior recombinación del
exogenote con el genomio de la célula en cuestión (endogenote).
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La transformación fue el primer proceso de
transferencia genética que se describió en los procariotas, y este hallazgo
constituyó la base para suministrar el primer dato incontrovertible acerca de
la naturaleza química del material genético: a partir de 1944 empezó a quedar
claro que era el ADN el portador de la información genética de los seres
vivos.
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 Cepas S
vivas inoculadas en ratones à ratón muere
Cepas R
vivas inoculadas en ratones à ratón vive
Cepas S
muertas por calorà ratón vive
Cepas S
muertas por calor + R vivas à ratón muere. La autopsia revela la presencia de
neumococos vivos virulentos (tipo S).
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9.1.2 CONJUGACION
Es el proceso de transferencia de información
genética desde una célula bacteriana donadora a otra receptora. Este proceso
fue descubierto por Joshua Lederberg y Edward Tatum en 1946. Este proceso es
promovido por determinados tipos de plásmidos, que portan un conjunto de genes
cuyos productos participan en el proceso, y que requiere contactos directos
entre ambas células, con intervención de estructuras superficiales
especializadas y de funciones específicas (pilus sexuales en los Gram negativos,
y contacto íntimo en los Gram positivos).
Este
proceso se lleva a cabo si la célula presenta el plásmido F, que contiene la información
genética para formar pili, puentes que sirven de unión citoplásmica entre
dos bacterias. La célula que presenta el plásmido se denomina F+; la célula que no lo contiene se llama F-. La bacteria F+ (donadora de información) se
une a una bacteria F- (receptora) mediante uno de sus pili.
A través
de él introduce una hebra del plásmido F, de forma que la bacteria F- se
convierte en bacteria F+.En ocasiones el plásmido se introduce en el anillo
del ADN bacteriano. Entonces, la bacteria donadora se denomina Hfr (High frequency of recombination). De esta forma la bacteria Hfr puede
donar a otras células cualquier gen de su ADN.
9.1.3 TRANSDUCCION
Es un proceso mediante el cual el ADN es
transferido desde una bacteria a otra mediante la acción de un virus. También
se utiliza para designar al proceso mediante el cual ADN exógeno es introducido
en una célula mediante un vector viral. Esta es una herramienta que usualmente
utilizan los biólogos moleculares para introducir en forma controlada un gen
extraño en el genoma de una célula receptora
CICLOS LÍTICO Y LISOGÉNICO
El proceso de transducción puede ocurrir tanto
durante un ciclo lítico como durante un
ciclo lisogénico.
El bacteriófago entra en ciclo lisogénico cuando
su genoma se integra en el cromosoma bacteriano, donde puede permanecer latente
durante miles de generaciones. Si el lisógeno es inducido (por exposición a luz
UV, por ejemplo) el genoma del fago se escinde del cromosoma bacteriano e
inicia un ciclo lítico, que desemboca en la lisis de la célula y la liberación
de las nuevas partículas víricas.
Cuando una célula es atacada por
un virus bacteriófago, la bacteria genera nuevas copias del ADN vírico. En la
fase de ensamblaje se pueden introducir fragmentos de ADN bacteriano en la
cápsida del virus. Los nuevos virus ensamblados infectarán nuevas células.
Mediante este mecanismo, una célula podrá recibir ADN de otra bacteria e
incorporar nueva información.
Los bacteriófagos son virus que
parasitan bacterias. Tienen una estructura compleja formada por una cabeza, que
contiene el material genético, y una cola que consta de unas fibras con las que
se anclan a la superficie bacteriana. El material genético del bacteriófago
pasa desde la cabeza, a través de la cola, hasta el interior de la bacteria.
9.1.4 RECOMBINACION
Es el proceso por el cual una
hebra de material genético (usualmente ADN; pero también puede ser ARN) es rota
y luego unida a una molécula de material genético diferente. La recombinación
de eucariotas comúnmente se produce durante la meiosis como entrecruzamiento
cromosómico entre los cromosomas apareados. Este proceso conduce a que la progenie
tenga diferentes combinaciones de genes de sus padres y puede producir alelos
quiméricos. En biología evolutiva se cree que esta mezcla de genes tiene varias
ventajas, incluyendo que permite a los organismos que se reproducen sexualmente
y evitar el trinquete de Muller.
TIPOS DE RECOMBINACION
Recombinación homóloga: La recombinación homóloga (también llamada recombinación general) sucede durante la profosa I de la meiosis y tiene lugar entre las largas regiones de ADN cuyas secuencias son homólogas, es decir altamente similares pero no idénticas.
Recombinación específica de sitio: Otro tipo de recombinación es la específica de sitio que tiene lugar
por rotura y posterior unión de regiones de homología corta y específica
de dos ADN diferentes, o dentro de la misma molécula. Ocurre en virus
(por ejemplo, el Bacteriofago T4) y en plásmidos.
Recombinación no homóloga: La recombinación puede ocurrir entre secuencias de ADN que no contienen secuencias homólogas. Esto es conocido como recombinación no homóloga. Acontece raramente en procariotas y levaduras, pero es más frecuente en células de mamíferos.
9.1.5 TRANSFECCION
Consiste en la introducción de material genético externo en células eucariotas
mediante plásmidos, vectores víricos
(en este caso también se habla de transducción) u otras
herramientas para la transferencia.
Las técnicas de transfección
celular, que se han desarrollado fundamentalmente para permitir la introducción
de ácidos nucleicos en el interior de las células, han permitido en gran medida
ampliar los conocimientos acerca de la regulación génica y de la función de las
proteínas en los sistemas celulares. Actualmente se emplean en gran número de
aproximaciones experimentales, en la generación de animales transgénicos, en la
selección de líneas celulares modificadas.
La introducción de una
construcción de DNA recombinante en la que se ha situado el CDS (secuencia
codificante) de un gen reportero (luciferasa, 'green fluorescent protein',
beta-galactosidasa, cloramfenicol acetiltransferasa -CAT-, etc..) bajo una
secuencia de regulación que se desea estudiar permite medir con facilidad tasas
de expresión génica en diferentes situaciones experimentales.
9.2 MECANISMOS DE TRANSFERENCIA ARTIFICIAL
9.2.1 FISICOS
Los métodos físicos utilizan
técnicas como la microinyección con una fina aguja de cristal y la
electroporación (exposición de las células aun choque eléctrico).
Microinyección: Resulta ser una técnica muy potente y eficaz, ya
que 1 de cada 5 células consigue incorporar el DNA foráneo de forma permanente.
El problema de esta técnica es que exclusivamente se puede inyectar una célula
cada vez, y por tanto no es el más recomendable para una terapia médica debido
a que es demasiado laboriosa como para obtener un número de células indicadas
(suficientes, aproximadamente un millar o más) para que el tratamiento tenga
éxito. Es una técnica muy efectiva
aunque laboriosa. Es el método que se emplea en la introducción del DNA
recombinante en las células embrionarias en el proceso de obtención de animales
transgénicos
Electrooración: Es una técnica que
crea o que dota a la membrana de cierta permeabilidad al DNA durante unos pocos
segundos debido a una descarga eléctrica. Si la célula o grupo de células
sometidas, a dicho choque eléctrico están sumergidas en un medio rico en
plásmidos, alguno de ellos puede penetrar en una célula. El problema que
suscita este método es que los choques eléctricos no pueden producir los
efectos deseados en algunas células y dañarlas o matarlas debido a esta causa.
Una vez introducida la molécula
de DNA recombinante en el interior de las células producirá su efecto
permitiendo, por ejemplo :
- Seleccionar células que hayan incorporado el DNA. Este sería el caso del aislamiento de clones celulares que presentaran expresión de un determinado producto. Es posible por la incorporación en el propio vector de marcadores de selección, típicamente la resistencia de G418 (neomicina),
9.2.2 QUIMICOS
Método del fosfato
cálcico. Basado en la obtención de un precipitado
entre el cloruro de calcio y el DNA en una solución salina de fosfatos. En esta
situación co-precipitan formando unos agregados que son endocitados/fagocitados
por las células. Aparentemente el agregado con calcio protege al DNA de la
degradación por las nucleasas celulares. El tamaño y la calidad del precipitado
es crítico para el éxito del proceso, que se ve afectado por factores tales
como pequeños cambios en el pH de la solución, etc...
Método del DEAE
dextrano. Basado en la obtención de complejos entre la
resina DEAE y el DNA. Los polímeros de DEAE dextrano o polybreno tienen una
carga que les permite unirse a las muy negativamente cargadas moléculas de DNA.
El DNA acomplejado se introduce en las células mediante choque osmótico
mediante DMSO o glicerol. El uso de DEAE dextrano se limita a las
transfecciones transientes.
Método DNA desnudo. El DNA desnudo (técnica en fase altamente experiemtal) es incapaz de
entrar en una célula y aún consiguiendo entrar en ellas es rápidamente
degradado. La línea de investigación busca incorporar esas secuencias de DNA a
un transportador, que le encierra y le lleva hasta la célula Diana en dónde a
través de interacciones de membrana se asocia con ella para entregar el
material al interior.
Método Péptidos fusiogénicos Los péptidos fusiogénicos surgen en una linea de trabajo que nos permita paliar aquellas características del DNA desnudo que nos impiden la entrada.
Método Péptidos fusiogénicos Los péptidos fusiogénicos surgen en una linea de trabajo que nos permita paliar aquellas características del DNA desnudo que nos impiden la entrada.
Estos
péptidos fusiogénicosa se utilizan para compactar DNA. y de este modo adoptan
DNA con proteínas ricas en cargas +, del tipos Histonas. Esto supone una
condensación considerable, (visible con MET) ya que el DNA aparece en la forma
de partículas de 50-150 nanometros, pero sólo un cierto grado de condensación
permite que 1 transportador incluya 1 molécula de DNA. Asimismo la reducción de
tamaño del DNA hasta unos 20 nanometros facilitaría el paso a la célula y hasta
el núcleo, incrementando su protección contra las nucleases citoplasmáticas. En
el proceso de penetración celular, los transportadores sintéticos (si su carga
neta es +) interactuan con Aminoazucares de la Membrana plasmáticacon (carga -)
para producir la incorporación a la célula en forma de endosomas. Por tanto
tenemos un problema más a superar.
Método de Liposomas: Los
liposomas estan formados por DNA y
lipidos no inmunogénicos cargados positivamente (lípidos cationicos).
