VIDEO DEL EXPERIMENTO DE MESELSON Y STHAL

CONCLUSIÓN

El experimento permitió confirmar las teorías de James Watson y de Francis Crick sobre el método de replicación del ADN

TAREA " EXPERIMENTO DE MESELSON Y STHAL"

INSTITUTO TECNOLÓGICO 

 DE CD ALTAMIRANO

  BIOLOGIA MOLECULAR

                  ALUMNA

             MARICRUZ HERRERA MAYA

           PROFESOR

 FRANCISCO JAVIER PUCHE ACOSTA

CARRERA:    LIC.BIOLOGIA

SEMESTRE: VI          GRUPO: "A" 

" EXPERIMENTO DE MESELSON Y STHAL"

 El experimento de Meselson-Stahl fue un experimento realizado en 1957 por Matthew Meselson y Franklin Stahl en el que se demostró que la replicación de ADN era semiconservadora. Una replicación semiconservadora es aquella en que la cadena de dos filamentos en hélice del ADN se replica de forma tal que cada una de las dos cadenas de ADN formadas consisten en un filamento proveniente de la hélice original y un filamento nuevo sintetizado.

 HIPÓTESIS

Para investigar la forma de replicación del ADN, Meselsohn y Stahl idearon una forma muy ingeniosa que se basa en dos premisas fundamentales, por una parte está el hecho de que el nitrógeno es uno de los principales elementos del ADN, y por la otra el nitrógeno posee dos isótopos que pueden ser distinguidos mediante técnicas de laboratorio.

Aunque el ¹⁴N es el isótopo más abundante del nitrógeno, el ADN es también viable con el isótopo ¹⁵N el cual es más pesado. El isótopo ¹⁵N no es radioactivo, solo es más pesado que el nitrógeno común.

De esta forma Meselsohn y Stahl mediante un inteligente planteo del experimento, en el que utilizaron bacterias y observaron cómo replicaban su ADN, pudieron obtener información que les permitió identificar el mecanismo de replicación del ADN y descartar ciertas teorías alternativas.

DESARROLLO DEL EXPERIMENTO

Se realizó un cultivo de E. coli durante varias generaciones en un medio con ¹⁵N. Al extraer ADN de estas células y centrifugarlo en un gradiente de cloruro de cesio, las moléculas de ADN se situaban en el punto donde su densidad igualaba la del medio. El ADN de estas células tenía una mayor densidad que el de otras cultivadas con ¹⁴N. Posteriormente, las células de E. coli que sólo contenían ¹⁵N en su ADN se colocaron en un medio con ¹⁴N y se les permitió que se replicaran una sola vez. Se extrajo el ADN de estas células y se comparó con el preparado con ¹⁴N y con el preparado con ¹⁵N, encontrando que su densidad era prácticamente el promedio. Dado que una replicación conservadora hubiera producido iguales cantidades de ADN de mayor y menor densidad (pero sin producir ADN de una densidad intermedia), se descartó que la replicación siguiera el mecanismo conservador. Sin embargo, este resultado era consistente tanto con una replicación semiconservadora como con una de tipo dispersante. Una replicación semiconservadora hubiera dado por resultado una doble hélice de ADN donde un filamento tiene ¹⁵N mientras que el otro filamento tiene ¹⁴N, mientras que una replicación dispersante hubiera dado por resultado una doble hélice de ADN con ambos filamentos conteniendo mezclas de ¹⁵N y ¹⁴N; en ambos casos la densidad del ADN tendría un valor promedio entre las densidades de los ADN de ¹⁵N y ¹⁴N.

Se extrajo ADN de células que habían crecido por varias generaciones en un medio con ¹⁵N, y a las que se les había permitido que realizaran dos replicaciones en un medio con ¹⁴N. Al analizar estas células se encontró que contenían cantidades iguales de ADN con dos densidades distintas, una igual a la obtenida tras una sola replicación en un medio con ¹⁴N, mientras que la otra correspondía al ADN producido exclusivamente con ¹⁴N. Este resultado era claramente inconsistente con una replicación dispersante, que hubiera dado como producto ADN con una densidad única e inferior a la de una sola generación, pero mayor que la de ¹⁴N, ya que el ADN original con ¹⁵N se habría repartido de forma uniforme entre todos los filamentos de ADN. Este resultado era consistente con una replicación semiconservadora, en cuanto a que la mitad del ADN de segunda generación tiene un filamento original con ¹⁵N y otro con ¹⁴N, lo que da como resultado un ADN con una densidad intermedia, mientras que la otra mitad del ADN contiene en su totalidad ¹⁴N --un filamento sintetizado en la primera división y otro en la segunda división. Este descubrimiento fue sumamente importante en el desarrollo de la biología y es de gran ayuda en la investigación y tratamiento de enfermedades (por ejemplo cancer).

 PASOS DEL EXPERIMENTO DE MESELSON Y STHAL

1.- Cultivaron las bacterias en un medio con N15 o pesado durante un tiempo por lo que las bacterias que se van obteniendo tendrán ADN pesado; al hacer la centrifugación se obtendría lo siguiente: 

2.-Pasaron unas bacterias del medio pesado a medio ligero (con N¹⁴), durante media hora (tiempo de una  duplicación), hicieron la centrifugación y obtuvieron lo siguiente

 

3.- Se obtuvieron ADNs semiligeros; con este resultado se descarta la hipótesis conservativa

 4.-Repitieron la experiencia, pero durante 

una hora(tiempo de dos duplicaciones).  

5.-Se obtuvieron ADNs semiligeros y ligeros; con este resultado se descarta la hipótesis dispersiva

CONCLUSIÓN

El experimento de Meselson y Sthal concluyo en que la replicación del ADN es un proceso semiconservativo

En el que cada una de las moléculas hija contiene una hebra de la molécula original y otra neoformada.

Los resultados demuestran que después de una generación, el ADN es mitad pesado (la hebra progenitora) y mitad ligero (la hebra recién sintetizada). Esto significa que el 100% de las moléculas bicatenarias son de densidad intermedia. 

Después de la segunda generación, la mitad de las hebras nuevas son ligeras (con 14N-ADN del progenitor y 14N-ADN sintetizado) y la mitad son de densidad intermedia (con 15N-ADN del progenitor y 14N-ADN de nueva síntesis). Este resultado es el predicho por la replicación semiconservadora.

 

BIBLIOGRAFIA

http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/Replicacion/Replicacion.htm

http://www.hiperbiologia.net/adn/adntema1.htm

http://www.biologia.arizona.edu/molecular_bio/problem_sets/nucleic_acids/06t.html

Libro: Biología, quinta edición. (Salomón Berg Martín).

Encarta 2003.

Dibujo 1.

Ácido desoxirribonucleico

Dibujo 2.

Reaplicación del ADN

Dibujo 3.

Experimento Meselson y Sthal

UNIDAD 4 REPLICACION DEL ADN

  INSTITUTO TECNOLOGICO 

 DE CD ALTAMIRANO

  BIOLOGIA MOLECULAR

                  ALUMNA

 MARICRUZ HERRERA MAYA

           PROFESOR

 FRANCISCO JAVIER PUCHE ACOSTA

CARRERA:    LIC.BIOLOGIA

SEMESTRE: VI          GRUPO: "A" 

UNIDAD 4 

REPLICACION DEL ADN

INTRODUCCION

El ácido desoxirribonucleico, frecuentemente abreviado como ADN. Hasta hace unos años era completamente desconocido para todos como era que funcionaba la sangre y sobre todo de que manera podían pasar las características de un ser vivo a otro este   descubrimiento hecho por james Watson y Crick aun son importantes para nuestras vidas

OBJETIVOS

* Conocer la historia del descubrimiento del ADN, para que sirva, como funciona, de qué manera afecta o ayuda a los científicos e identificar cómo funcionan las bases nitrogenadas en el ADN y en los seres vivos.

 

* Describir  el proceso de la replicasion del ADN.

        
        4.1  REPLICACION DEL GENOMA PROCARIOTE

En este proceso interviene un grupo de enzimas conocido genéricamente como ADN polimerasa. Este complejo multienzimático va incorporando nucleótidos a la cadena que se va sintetizando utilizando como molde una de las hebras de la cadena antigua. Esta polimerización se produce añadiendo nuevos nucleótidos al extremo 3' de una hebra de ADN en crecimiento. Por ello se dice que la síntesis del ADN se produce en dirección 5'<3' mientras la ADN polimerasa va leyendo la hebra molde en dirección 3'o5'.

Por consiguiente, para que se produzca la síntesis de ADN por la ADN polimerasa, además de la enzima que realiza la polimerización en sí, es necesario otro juego de proteínas que van desenrollando la doble hélice de ADN delante de la ADN polimerasa para permitir que ésta funcione. Estas enzimas se denominan genéticamente topoisomerasas y girasas. La acción de las topoisomerasas y girasas permite abrir unas burbujas en la doble hélice de ADN en las que entra el complejo de la ADN polimerasa y realiza la polimerización.

 Sin embargo, la ADN polimerasa no es capaz de iniciar la polimerización del ADN sino que solamente es capaz de continuarla. Para que la ADN polimerasa funcione es necesario que exista un extremo 3' libre al que añadir un nuevo nucleótido. ¿Quién pone ese extremo 3' libre?. En todos los casos (salvo algunas excepciones de ciertos virus) ése extremo 3' viene de una pequeña cadena de ARN que se ha sintetizado como paso inicial de la replicación del ADN. Por consiguiente, la replicación del ADN comienza con la síntesis de una pequeña molécula de ARN que luego continúa como molécula de ADN. Esta pequeña molécula de ARN se denomina cebador o primer„ y es sintetizada por otro complejo multienzimático denominado ARN polimerasa.

La síntesis de ADN (replicación) va procediendo detrás de la horquilla que se forma en el punto en que se van abriendo las dos hebras de ADN molde por acción del complejo de girasas y topoisomerasas. De esta forma, la hebra que se va sintetizando es continua. Sin embargo, la hebra que se sintetiza usando como molde la complementaria de la anterior no puede ser continua porque la acción de las topoisomerasas y girasas se produce detrás del punto de origen de la transcripción. Por esto, de las dos hebras hijas, una será continua y l a otra discontinua. Los fragmentos de ésta última se unirán entre sí mediante la acción de otra enzima denominada ADN ligasa que une los fragmentos anteriores.

En las bacterias, cuyo material genético es cerrado, no tiene extremos, sólo existe un origen de replicación del ADN en cada molécula de ADN. Esto es válido para los plásmidos y para los cromosomas bacterianos. Asimismo, esto se cumple también en el ADN de los orgánulos celulares procarióticos presentes en las células eucarióticas.

En las células procariotas
Hay 1 lugar de origen de replicación que se muestra en la horquilla de replicación (replication fork) y que señala el avance de la copia. La horquilla (fork) indica que se está haciendo la separación y la replicación a la vez. El avance es bidireccional, lo que acorta el tiempo. En el sitio en que empieza la replicación se organizan las proteínas en un complejo llamado replisma. La replicación del ADN en procariotas sucede a una velocidad de 500 nucleótidos por segundo. 

4.2 REPLICACION DEL GENOMA EUCARIOTE 

La replicación del ADN eucariótico es esencialmente igual a la del procariótico aunque presenta ciertas diferencias los cromosomas eucarióticos son abiertos, en lugar de cerrados, y el número de orígenes de transcripción es múltiple en cada cromosoma en lugar de tener uno solo por cromosoma.

En las células procariotas

El proceso es esencialmente el mismo pero el ADN es mucho más grADNe y linear. Hay varios orígens de replicación y es bidireccional. El avance es más lento que en procariotas ya que hay más proteínas asociadas al ADN que hay que soltar. La replicación del ADN, que ocurre una sola vez en cada genración celular necesita de muchos "ladrillos", enzimas y una gran cantidad de energía en forma de ATP (recuerde que luego de la fase S del ciclo celular , las células pasan a una fase G a fin de, entre otras cosas, recuperar energía para la siguiente fase de la división celular). La replicación del ADN en el ser humano se realiza a una velocidad de 50 nucleótidos por segundo. Los nucleótidos tienen que ser armados y estar disponibles en el núcleo conjuntamente con la energía para unirlos.

  

Prácticamente la mitad del ADN eucariota corresponde a secuencias nucleotídicas repetidas. 

Existen secuencias altamente repetitivas (de función desconocida, salvo para la secuenciación génica del hombre): * SATÉLITES: 5-50 pares de bases, repetidas hasta un millón de veces.  * MINISATÉLITES: 12-100 pares de bases, repetidas un número variable de veces, son marcadores genéticos moleculares de cada persona. * MICROSATÉLITES: 1-5 pares de bases, en grupos de 10-50 copias.

Secuencias moderadamente repetitivas:

* Telómeros, se encuentran en los extremos de los cromosomas. En el ser humano esta secuencia es TTAGGG y se repite unas 2500 veces. Recordando la replicación del ADN... la cadena avanzada puede replicarse hasta el extremo, pero como la cadena retrasada no tiene un cebador en el extremo 5´ del cromosoma, en cada replicación se produce un acortamiento de la nueva hebra formada. De este modo el nuevo ADN carece de esta última porción repetitiva ya que el mecanismo de reparación corta este extremo. En células en activa división (médula ósea y línea germinal) una telomerasa cataliza el agregado de la porción faltante.

*  Secuencias codificadores de ARNt y ARNr: existen múltiples copias de ADN que codifican para estos ARN, ya que se precisan en grandes cantidades

            4.3 CONTROL GENETICO  DE LA REPLICACION

  Para que la replicación ocurra, la célula necesita las moléculas que constituyen los diferentes nucleótidos y una serie de enzimas que controlan el proceso en todo momento. Así es como se realiza:

1.- La replicación comienza con la rotura de los enlaces que unen las bases nitrogenadas complementarias de ambas cadenas. De esta forma, las dos hebras comienzan a desenrollarse. En este proceso intervienen enzimas que permiten la separación.

2.- Cada cadena va a servir de molde para la síntesis de una nueva cadena complementaria. Cuando ambas se separan, enzimas específicas van leyendo la información y uniendo los nucleótidos complementarios.

3.- De esta manera quedan formadas dos nuevas cadenas dobles. Ahora, cada una de las nuevas cadenas de doble hélice contiene una de las hebras del ADN de origen y otra nueva, por eso se dice que la replicación es semiconservativa.

El tiempo que tarda el ADN en replicarse es de alrededor de siete horas. En realidad, semejante proceso tendría que durar mucho más si la duplicación se realizara de una punta a la otra de cada cromosoma. Sin embargo, esto no ocurre. La célula utiliza “estrategias” mediante las cuales el material genético se duplica en períodos más cortos. La replicación del ADN ocurre en varios puntos a la vez, en distintos tramos de la molécula.

A.- Las enzimas separan las dos hebras de la cadena helicoidal de ADN en puntos específicos. Las enzimas ADN helicasa desenrollan cada hebra de ADN.

B.- La enzima ADN polimerasa lee cada hebra y fabrica una nueva uniendo los nucleótidos complementarios. La lectura de la cadena molde avanza hacia un lado en una hebra y hacia el otro, en la otra.

C.- Finalmente, se obtienen dos cadenas nuevas de ADN, una por cada hebra del ADN original.

 •Si lleva la información genética es necesario que se duplique para poder repartirla a las células hijas.

•Desde principios del S. XX, se sabe que los cromosomas llevan la información genética, ¿cómo se sabe?:

–El espermatozoide sólo pasa su núcleo al óvulo, en el núcleo están los cromosomas.

–Si los cromosomas están formados por proteínas y ADN , ¿quién de los dos lleva la información genética?

•Una experiencia que ayudó a resolver esta incógnita, fue la experiencia realizada por Griffith (1928) y explicada por Avery, MacLeod y McCarthy en 1952: 

Explicación: Las bacterias R, se transforman en S y producen la muerte del ratón. ¿Cómo?. Al calentar se destruyen las proteínas pero no el ADN              por lo que  fragmentos de ADN de las S pueden entrar en las R y las transforman en S         el ADN lleva la información genética. 

                    Primeras hipótesis sobre la replicacion del ADN

·           Semiconservativa     

ConservativaDispersiva

  4.4 REPLICACION IN VITRO DEL ADN (PCR)

Kornberg (discípulo de Ochoa), en 1956, aisló la enzima ADN-polimerasa (enzima capaz de unir nucleótidos de ADN in vitro), realizó la siguiente experiencia:

ADN polimerasa + Mg ⁺² + nucleótidos

trifosfato + hebra patrón   no se unían nucleótidos complementarios.

-   ADN polimerasa + Mg ⁺² + nucleótidos trifosfato + hebra patrón + un cebador (fragmento complementario)            se unían nucleótidos complementarios a la hebra patrón, pero siempre siguiendo la dirección de crecimiento 5’      3’.

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) Es una técnica clave utilizada en la genética molecular para reproducir una secuencia relativamente corta de ADN; este segmento de ADN a menudo es un gen o una parte crítica del gen y amplifica por PCR (Es decir, hace más copias de) la secuencia de interés que nos permite estudiar lo que la secuencia particular. Antes de PCR fue inventada, la amplificación de ADN se llevó a cabo en bacterias y tomó semanas para llevar a cabo. PCR utiliza las mismas moléculas que la naturaleza utiliza para copiar el ADN.

Con el fin de determinar si está o no amplificado el gen correcto o para comprobar si ese gen está presente, se utiliza electroforesis de agarosa. Agarosa crea una matriz que permite que las pequeñas moléculas de ADN para viajar más rápido y más grandes moléculas de ADN para viajar más lento separando así las moléculas de ADN de acuerdo con el tamaño cuando se aplica a través de un campo eléctrico.

Explicación

A. Las reacciones de ciclismo:

Hay tres pasos principales en una PCR, que se repiten durante 30 o 40 ciclos. Esto se hace en un ciclador térmico automatizado, que puede calentar y enfriar los tubos con la mezcla de reacción en un tiempo muy corto.

1. Desnaturalización (94-95 ° C) :
   Durante la desnaturalización, la doble cadena se funde, o desnaturaliza (Lo que significa abre) , Con el ADN de cadena sencilla y todas las reacciones enzimáticas detener (Por ejemplo: la extensión de un ciclo anterior) .
2. Recocido (54-60 ° C) :
   Los cebadores se jiggling alrededor de la cual es causada por el movimiento browniano. Los enlaces de hidrógeno se forman constantemente y roto entre el cebador de cadena sencilla y la plantilla monocatenario. Los bonos más estables duran un poco más (Cebadores que se ajustan exactamente) y en ese pequeño pedazo de ADN de doble cadena (Plantilla y cartilla) , La polimerasa puede conectar y empezar a copiar la plantilla. Una vez que hay unas pocas bases construidas en los enlaces de hidrógeno son tan fuertes entre la plantilla y la cartilla de que no se rompe más. La temperatura real de recocido está determinada por la secuencia del cebador utilizando sus temperaturas de fusión, referidos como Tm.
3. Extensión (68 - 74 ° C) :
   La extensión es cuando los nucleótidos libres que complementan la sola hebra de ADN se añadió en el extremo 3 'del cebador. Esta es la temperatura de trabajo ideal para la polimerasa. Los cebadores tienen una atracción fuerte a la plantilla, creado por enlaces de hidrógeno. Es más difícil de romper estos lazos de lo que es para añadir nucleótidos libres a los cebadores. Los cebadores pueden unirse al ADN monocatenario incluso si no son exactamente complementaria. Pero si el "partido" está con muy pocos nucleótidos, entonces hay un menor número de enlaces de hidrógeno. Así, el cebador puede caerse el nucleótido monocatenario debido a la temperatura más alta y no habrá extensión del fragmento (La única hebra de ADN que está intentando copiar.)
   Las bases (Complementaria a la plantilla) están acoplados a la imprimación sobre el lado 3 ' (La polimerasa añade dNTP desde 5 'a 3', la lectura de la plantilla de 3 'a 5' lado, las bases complementarias se añaden a la plantilla)

  Problema de la dirección en la replicacion del ADN in vivo

Cairns en 1963:

E. coli en un medio con timina marcada con tritio (H³), que emite partículas β que son captadas por película fotográfica.

*     Cada 2’ ó 3’ depositaba el cultivo sobre la placa fotográfica.

                        4.4.1 SECUENCIAS DEL ADN

Una secuencia de ADN o secuencia genética es una sucesión de letras representando la estructura primaria de una molécula real o hipotética de ADN o banda, con la capacidad de transportar información.

Las posibles letras son A, C, G, y T, que simbolizan las cuatro subunidades de nucleótidos de una banda ADN - adenina, citosina, guanina, timina, que son bases covalentemente ligadas a cadenas fosfóricas. En el típico caso, las secuencias se presentan pegadas unas a las otras, sin espacios, como en la secuencia AAAGTCTGAC, yendo de 5' a 3' de izq. a derecha.

Una sucesión de cualquier número de nucleótidos mayor a cuatro es pasible de llamarse una secuencia. En relación a su función biológica, que puede depender del contexto, una secuencia puede tener sentido o antisentido, y ser tanto codificante o no codificante. Las secuencias de ADN pueden contener "ADN no codificante."

Las secuencias pueden derivarse de material biológico de descarte a través del proceso de secuenciación de ADN.

En algunos casos especiales, las letras seguidas de A, T, C, y G se presentan en una secuencia. Esas letras representan ambiguedad. De todas las moléculas muestreadas, hay más de una clase de nucleótidos en esa posición. Las reglas de la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada (IUPAC) son las que siguen:

 A = adenina

C = citosina

G = guanina

T = timina

R = G A (purina)

Y = T C (pirimidina)

K = G T (keto)

M = A C (amino)

S = G C (enlaces fuertes)

W = A T (enlaces débiles)

B = G T C (todos y A)

D = G A T (todos y C)

H = A C T (todos y G)

V = G C A (todos y T)

N = A G C T (cualquiera)

Secuenciación de Maxam-Gilbert

En 1976-1977, Allan Maxam y Walter Gilbert desarrollaron un método para secuenciar ADN basado en la modificación química del ADN y posterior escisión en bases específicas Aunque Maxam y Gilber publicaron su secuenciación química dos años antes del trascendental artículo de Sanger y Coulson sobre su método de secuenciación "más-menos",la secuenciación de Maxam y Gilbert rápidamente se hizo más popular hasta que se pudo utilizar ADN directamente, mientras que el método inicial de Sanger requería que cada comienzo de lectura fuera clonado para producir un ADN de cadena simple. No obstante, con el desarrollo y mejora del método de terminación de la cadena (ver más adelante), la secuenciación de Maxam y Gilbert ha quedado en desuso debido a su complejidad técnica, el uso extensivo de productos químicos peligrosos y dificultades para escalarla. Además, a diferencia del método de terminación de la cadena, los reactivos que se usan en el método de Maxam y Gilbert no se pueden adaptar para utilizarse en un kit biológico estándar.

Secuenciación por terminador fluorescente

Una alternativa al marcado del cebador es el marcado de los terminadores de la cadena, un método conocido como "secuenciación por terminador fluorescente". La mayor ventaja de este método es que la secuenciación se puede llevar a cabo en una sola reacción, en lugar de en cuatro reacciones como en el método del cebador marcado. En una secuenciación por terminador fluorescente se marcan cada uno de los cuatro didesoxinucleótidos que terminan la cadena con un colorante fluorescente diferente, con fluorescencias a diferentes longitudes de onda. Este método es atractivo por su gran capacidad y rapidez y actualmente es el método de referencia en la secuenciación automatizada con analizadores de secuencia controlados por computadora (ver más abajo). Entre sus limitaciones potenciales están los efectos de los terminadores fluorescentes en el fragmento de ADN, que produce alturas y formas de picos desiguales en los registros de secuencia de ADN del  cromatograma tras la  electroforesis capilar. Este problema se ha solventado en gran medida con la introducción de nuevos sistemas enzimáticos de polimerasas de ADN y colorantes que minimizan la variabilidad de la incorporación, así como métodos para eliminar los "pegotes de colorante" producidos por ciertas características químicas de los colorantes que pueden dar lugar a artefactos en los registros de secuencia de ADN. El método de secuenciado por terminador fluorescente junto con analizadores de secuencia de ADN de alto rendimiento se utiliza ahora para la inmensa mayoría de los proyectos de secuenciación, puesto que es más fácil de llevar a cabo y tiene un coste menor que los anteriores métodos de secuenciación.

  Secuenciación alelo-específica por bisulfito

 La secuenciación por bisulfito es una variante de la secuenciación Sanger utilizada para el mapeo de metilaciones alelo-específicas en los sitios CpG. Se extrae el ADN a secuenciar y se fragmenta con el fin de facilitar la posterior desnaturalización a la que se va a someter para separar las dos hebras de ADN. A continuación se incuba en presencia de bisulfito entre 15 y 20 horas. Dicho compuesto actúa desaminando las citosinas del ADN convirtiéndolas en uracilo. Sin embargo, es incapaz de actuar sobre aquellas que se encuentren metiladas. El siguiente paso consiste en la amplificación de la región que queremos mapear por PCR y su posterior secuenciación. Finalmente, se compara la secuencia obtenida con la de un control que no ha sido sometido a la acción del bisulfito: aquellas citosinas que estuviesen metiladas aparecerán como tales en el control, mientras que en la muestra tratada serán sustituidas por una timina.

La secuenciación alelo-específica por bisulfito presenta algunas limitaciones, entre las cuales se encuentran las siguientes:

-Conversión incompleta: La secuenciación mediante bisulfito depende de la conversión de cada uno de los residuos de citosina no metilados a uracilo. Si la conversión es incompleta, los posteriores análisis que se realicen interpretarán incorrectamente las citosinas no metiladas no convertidas en uracilo como citosinas metiladas, dando lugar a falsos positivos para la metilación.Sólo las citosinas que se encuentren en cadenas simples de ADN serán susceptibles de ser atacadas por bisulfito por lo que el paso de desnaturalización del ADN es crítico en este análisis.Es importante por tanto optimizar parámetros como la temperatura y la concentración de sales para mantener el ADN desnaturalizado y así permitir una conversión completa por bisulfito. Por otra parte también se ha propuesto que embebiendo el ADN en gel de agarosa se incrementa el grado de separación debido a que se mantienen las cadenas separadas.

-Degradación del ADN durante el tratamiento con bisulfito: Es una de las limitaciones más importantes de este método y tiene lugar paralelamente a la conversión. Para que se produzca una total conversión son necesarias una serie de condiciones tales como largos tiempos de incubación, temperatura elevada y altas concentraciones de bisulfito. Estas condiciones en su conjunto pueden promover la degradación del ADN en una proporción elevada. Esto puede suponer un grave problema si partimos de muestras con una baja concentración de ADN o de muestras tomadas post-mortem, además dicha degradación dará lugar a pequeñas roturas al azar a lo largo de la cadena de ADN lo que puede dar lugar a errores durante la amplificación por PCR.

-Desulfonación incompleta de los residuos de pirimidina: Una inadecuada alcalinización de la solución puede tener como consecuencia una incompleta desulfonación de los residuos de pirimidina, lo cual a su vez puede afectar negativamente a las polimerasas de ADN, las cuales serán incapaces de replicar la cadena molde.Esta situación se puede evitar monitorizando el pH de la solución asegurando así que se produzca una desulfonación completa.

CONCLUSION

 El ADN contiene la información hereditaria correspondiente a la especie. Y el ARN requiere para la  sintesis de proteinas la presencia de los ribosomas en las células ya que en el momento de la duplicación de los cromosomas la moléculas de ADN de abre gradualmente por los puentes de hidrógeno. El papel de las moléculas de ADN en la transmisión del  codigo genético rompiendo células de Escherichia Coli, una bacteria de la flora intestinal, separando sus componentes en varias fracciones.
Pero si el ADN es el responsable de la transmisión de la información genética debe ser capaz, no solo de reproducirse, con lo cual se consigue conservar esta información de padre a hijos sino también debe  poder transmitirlo.

                                                         BIBLIOGRAFIA

 http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/Replicacion/Replicacion.htm

http://www.hiperbiologia.net/adn/adntema1.htm

http://www.biologia.arizona.edu/molecular_bio/problem_sets/nucleic_acids/06t.html

Libro: Biología, quinta edición. (Salomón Berg Martín).

• Ansorge, W.J. (2009). «Next-generation DNA sequencing techniques.». New Biotechnology 25 (4).
• Diggle, M. A. (2004). «Pyrosequencing™». Molecular Biotechnology 28.
• França, L. T. C. (2002). «A review of DNA sequencing techniques.». Quarterly Reviews of Biophysics 35 (2).
• Hutchinson, C. A. (2007). «sequencing: bench to bedside and beyond.». Nucleic Acids Research 35 (18).